細胞凋亡實驗步驟

 

 細胞凋亡檢測實驗

 

細胞凋亡檢測可以：

（1）用于腫瘤細胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標本研究；

（2）應用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；

（3）對相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

實驗方法原理

本實驗用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。

 

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。

細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當細胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進入細胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

實驗步驟

一、試劑準備

 

1.  三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

 

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

 

3.  EDTA緩沖液：5mol/L；

 

4.   堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

 

5.        醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

注意事項

1.  誘導培養(yǎng)HL-60細胞時間要準確；

 

2.  熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。